蛋白質(zhì)濃度測(cè)定是用于計(jì)算純化方法的回收率的重要方法。常用的測(cè)定方法包括雙縮脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白濃度檢測(cè)法等。其中常用的方法就是BCA法。BCA 全稱是Bicinchoninic Acid Assay， 也叫Smith Assay，這個(gè)方法是由Paul K. Smith 發(fā)明的。這個(gè)方法通過(guò)展示不同濃度樣品的顏色變化來(lái)判斷蛋白的濃度。

檢測(cè)原理

BCA是一種堿性的水溶性復(fù)合物，性質(zhì)穩(wěn)定。在其提供的堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+，Cu+繼而與BCA試劑螯合，從而產(chǎn)生藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在562nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強(qiáng)、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，靈敏度高而得到廣泛應(yīng)用，但其也易受溫度、孵育時(shí)間的影響。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液

1. 配制 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品體系（線性范圍 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)品制備各 2 種配置方法，請(qǐng)根據(jù)習(xí)慣選用恰當(dāng)方式）。【注】：BSA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 2 mg/mL，稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋

白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用水或 1 X PBS 進(jìn)行稀釋。BSA 標(biāo)準(zhǔn)品體系配制表（配制后可放置于 4℃ 冰箱多次使用）

2. 配制 BCA 工作液

① 計(jì)算所需要的總 BCA 工作液體積。總 BCA 工作液體積=（標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+待測(cè)樣品數(shù)量）x 重復(fù)數(shù) x 每個(gè)

樣品所需要的 BCA 工作液。【注】：試管法檢測(cè)時(shí)每個(gè)樣品加 2.0 mL BCA 工作液，微孔板檢測(cè)每個(gè)

樣品加 200 μL BCA 工作液。

② 配制 BCA 工作液：50 體積的 BCA 試劑 A 中加入 1 體積的 BCA 試劑 B（A:B=50:1），充分混勻。【注】：BCA 工作液裝入密封容器內(nèi)，室溫條件 24h 穩(wěn)定。

二、檢測(cè)方法

1. 試管檢測(cè)方法（樣品:BCA工作液=1:20）

2.微孔板檢測(cè)方法（樣品: BCA 工作液=1:20）

① 各取 10 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到微孔板中。【注】：樣品與工作液比例為 1:20，檢測(cè)范圍為 125-2000μg/mL。若樣品濃度非常低，可使用 25μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)（即 1:8），這時(shí)試劑盒的檢

測(cè)范圍為 20-2000 μg/mL。

② 每孔加入 200 μL BCA 工作液，槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

③ 冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的 562 nm 波長(zhǎng)范圍處檢測(cè)吸光度。

④ 根據(jù) BSA 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（ X-蛋白濃

度μg/mL；Y-最終的 OD 562nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

注意事項(xiàng)

在進(jìn)行BCA法檢測(cè)蛋白濃度的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，精確性和可靠性是至關(guān)重要的。以下是一些關(guān)鍵的操作要點(diǎn)和在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能遇到的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決策略：

? 試劑的準(zhǔn)備和存儲(chǔ)：確保所有試劑在使用前充分混合且在推薦的溫度下存儲(chǔ)。試劑的新鮮度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，過(guò)期或不當(dāng)存儲(chǔ)的試劑可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

? 操作順序的嚴(yán)格遵守：在進(jìn)行BCA實(shí)驗(yàn)時(shí)，嚴(yán)格按照試劑添加順序和操作步驟進(jìn)行，避免任何步驟的顛倒或省略。這些步驟設(shè)計(jì)的順序是為了提高反應(yīng)效率和結(jié)果的一致性。